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       2024年7月4日（周四），中國老年保健協(xié)會(huì)、一味書院主辦的【檢驗(yàn)月月壇】系列會(huì)議第13期“多方法學(xué)助力自身抗體實(shí)驗(yàn)室檢測”全國直播會(huì)在線上如期召開。大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院李士軍教授擔(dān)任大會(huì)主席并致辭，遼寧省中醫(yī)院張程教授，以及青島市婦女兒童醫(yī)院宋金蓮教授擔(dān)任本次會(huì)議的講者嘉賓。同時(shí)大會(huì)還邀請(qǐng)了中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院安成教授、哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院周海舟教授作為本次會(huì)議的討論嘉賓。幾位專家主要圍繞“多方法學(xué)助力自身抗體實(shí)驗(yàn)室檢測”進(jìn)行了深入的交流和討論。

大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院  李士軍教授

       開幕致辭環(huán)節(jié)，李士軍教授對(duì)線上各位觀眾的參與表示歡迎，對(duì)本次會(huì)議的各位講者和主持人表示感謝。李士軍教授指出自身抗體檢測對(duì)于自身免疫性疾病的診斷、鑒別診斷、病情評(píng)估、治療監(jiān)測、預(yù)后判斷有著非常重要的作用，我國在自身免疫性疾病領(lǐng)域的深耕精作已經(jīng)取得了矚目的成績，檢驗(yàn)科已經(jīng)有能力為自身免疫性疾病的臨床實(shí)驗(yàn)室診斷提供更加全面、完善的檢測方法學(xué)和檢測項(xiàng)目，目前自身抗體檢測有多種方法學(xué)，每種方法學(xué)都有其獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值和局限性，今天的主題是多方法學(xué)聯(lián)合助力自身抗體實(shí)驗(yàn)室檢測，探討不同類型的自身抗體檢測也有不同的檢測策略。而每種方法學(xué)都有其獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值和局限性，今天的主題是多方法學(xué)聯(lián)合助力自身抗體實(shí)驗(yàn)室檢測，探討不同類型的自身抗體檢測也有不同的檢測策略。

       學(xué)術(shù)分享環(huán)節(jié)，張程教授為大家介紹了常見的自身免疫性疾病以及自身抗體對(duì)該疾病診療價(jià)值。自身免疫性疾病發(fā)病隱匿，表現(xiàn)復(fù)雜多樣，這給疾病診斷帶來了極大的困難。而自身抗體的檢測能用于輔助疾病的診斷、鑒別診斷，病情評(píng)估，判斷預(yù)后等重要作用，在自身免疫性疾病的診療過程起著重要作用。不僅如此，自身抗體檢測還對(duì)疾病有著預(yù)警作用。如定期檢測CCP，可以有助于提早發(fā)現(xiàn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。接下來張程教授介紹了臨床中較為常見的自身免疫疾病，如：系統(tǒng)性紅斑狼瘡、抗磷脂綜合征、ANCA相關(guān)血管炎、自身免疫性肝病、干燥綜合征。張程教授結(jié)合指南深入淺出的介紹了這幾個(gè)疾病的臨床癥狀以及相關(guān)抗體的臨床應(yīng)用，令我們受益匪淺。

       緊接著宋金蓮教授進(jìn)行了題為“多方法學(xué)助力自身抗體檢測”的學(xué)術(shù)報(bào)告。宋教授主要從三個(gè)方面展開講解，分別是自身抗體的臨床應(yīng)用和檢測策略、自身抗體檢測的方法學(xué)概述和檢測策略推薦。宋教授利用5個(gè)臨床病例生動(dòng)的闡述了自身抗體檢測對(duì)疾病診療的重要性，尤其是對(duì)于孕產(chǎn)婦和兒童的診療過程中發(fā)揮著重要作用。特別是在兒童群體中，系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病癥狀并不典型，往往容易誤診、漏診而耽誤治療。接下來宋教授介紹了目前國內(nèi)常見的自身抗體檢測方法，著重提到了間接免疫熒光、免疫印跡法、酶聯(lián)免疫吸附法、化學(xué)發(fā)光法，詳細(xì)介紹了每種檢測方法的優(yōu)勢和局限性。最后宋教授以指南為依據(jù)，推薦常見自身抗體檢測的策略。宋教授提到對(duì)于ANA檢測，推薦用間接免疫熒光法進(jìn)行ANA的總抗體篩查，同時(shí)對(duì)于ANA的特異性抗體，需要用免疫印跡法、化學(xué)發(fā)光法等進(jìn)行靶抗原確認(rèn)。由此保證ANA靶抗原的全面覆蓋及單指標(biāo)檢測的靈敏度，避免漏檢。對(duì)于抗dsDNA抗體，不但是系統(tǒng)性紅斑狼瘡的特異性指標(biāo)，其滴度變化與疾病活動(dòng)度密切相關(guān)，有隨訪監(jiān)測的價(jià)值。所以針對(duì)抗dsDNA抗體檢測，可應(yīng)用間接免疫熒光篩查，同時(shí)，ELISA和化學(xué)發(fā)光法等進(jìn)行定量監(jiān)測。對(duì)于ANCA是ANCA相關(guān)血管炎的重要血清學(xué)標(biāo)志。2017年國際ANCA檢測專家共識(shí)推薦IIFT和靶抗原確認(rèn)平行檢測或IIFT結(jié)果陽性，再進(jìn)行靶抗原確認(rèn)。

       學(xué)術(shù)報(bào)告后，李士軍教授主持討論環(huán)節(jié)，并與各位專家圍繞多方法學(xué)助力自身抗體實(shí)驗(yàn)室檢測相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行了深入的交流與分享。李教授結(jié)合本次會(huì)議的主題，以及線上觀眾的提問，提出了三個(gè)問題：

問題1：目前自身抗體檢測的方法眾多，其中化學(xué)發(fā)光自動(dòng)化程度高，而且定量檢測，相比之下其他方法學(xué)還有存在的必要性么？

安成教授：從眾多文獻(xiàn)的報(bào)道上來看，其實(shí)不同的方法學(xué)，在檢測的結(jié)果上有互補(bǔ)的作用。因?yàn)椴煌臋z測方法，它檢測的敏感性是完全是不一樣的，特異性也不一樣，就像宋教授介紹的，每種方法學(xué)都有獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值和局限性。例如間接免疫熒光，是以HEp-2細(xì)胞作為檢測基質(zhì)的經(jīng)典方法學(xué)，HEp-2是包含二百余種自身抗體靶抗原的“天然陣列”，以其作為基質(zhì)對(duì)ANA進(jìn)行IFA檢測，敏感性高，是目前公認(rèn)的ANA檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，是不能夠被其他方法學(xué)取代的。以及在指南中，也是推薦多方法學(xué)聯(lián)合檢測來降低漏診、誤診。比如：2018年國內(nèi)發(fā)布的ANCA檢測臨床應(yīng)用專家共識(shí)推薦以乙醇固定和甲醛固定的中性粒細(xì)胞為基質(zhì)的IIFT篩查及聯(lián)合ELISA確認(rèn)靶抗原，可有效提高AAV的臨床診斷性能。對(duì)于臨床疑似AAV患者，可采用ELISA或CLIA直接檢測靶抗原PR3和MPO。若檢測結(jié)果陰性，但臨床仍高度懷疑AAV，應(yīng)使用其他免疫學(xué)方法和/或IIFT-ANCA進(jìn)行重復(fù)檢測。此外，對(duì)于IIFT檢測，為了排除ANA的干擾，建議另采用HEp-2細(xì)胞+粒細(xì)胞（乙醇固定）基質(zhì)進(jìn)行輔助檢測。

周海舟教授：周教授同樣認(rèn)為化學(xué)發(fā)光法雖然優(yōu)勢明顯，但不能替代其他方法學(xué)。周教授舉例闡述。第一個(gè)例子是PLA2R檢測，目前是以間接免疫熒光和酶聯(lián)免疫吸附法為主要的檢測方法。間接免疫熒光使用的是細(xì)胞和組織為檢測基質(zhì)，保留了抗原的天然的構(gòu)象，所以它的敏感度是比較高的。而酶聯(lián)免疫吸附法檢測PLA2R特異性較強(qiáng)。目前梅奧診所對(duì)于檢測PLA2R給出的建議是間接免疫熒光和酶聯(lián)免疫吸附法共同檢測，保證了敏感性的同時(shí)，提高特異性。第二個(gè)例子是自身免疫性皮膚病的相關(guān)檢測，同樣也是間接免疫熒光和四種靶抗原BP180，BP230， Dsg-1和Dsg-3檢測同時(shí)進(jìn)行。間接免疫熒光方法學(xué)不但敏感性高，還可以區(qū)分是基底膜是表皮側(cè)還是真皮側(cè)陽性，但如果是表皮側(cè)陽性的那個(gè)提示呢，就是大皰性天皰瘡，而真皮側(cè)陽性，就提示是獲得性大皰性皮表皮松懈癥。而靶抗原檢測特異性較高，兩者結(jié)合不但能降低漏檢率，還能明確診斷，同時(shí)對(duì)臨床用藥選擇有一個(gè)很好的提示作用。

問題2：實(shí)際工作中，經(jīng)常會(huì)遇到不同方法學(xué)結(jié)果不一致的情況，對(duì)此現(xiàn)象一般如何處理和解決？

安成教授：安教授表示這個(gè)問題和第一個(gè)問題有一定的相關(guān)性。首先不同方法學(xué)采用的基質(zhì)或是抗原是不一樣的。間接免疫熒光檢測ANA使用的是HEp-2細(xì)胞為檢測基質(zhì)，敏感性是很好的。而且不同的核型也提示不同的疾病，對(duì)疾病的診療有著重要的作用。免疫印跡法、酶聯(lián)免疫吸附法、化學(xué)發(fā)光法使用的抗原都是經(jīng)過人工處理純化的，特異性很好。作為檢驗(yàn)人要把兩者結(jié)合應(yīng)用到臨床中去。

周海舟教授：周教授表示在實(shí)際工作中不僅是自身抗體檢測出現(xiàn)這種情況，其他的免疫檢測項(xiàng)目也會(huì)出現(xiàn)這種情況。常常是同一個(gè)患者在不同的醫(yī)院進(jìn)行檢測，出現(xiàn)檢測結(jié)果不一致的情況。針對(duì)這種情況我建議在復(fù)查時(shí)盡量在同一家醫(yī)院進(jìn)行檢測，同時(shí)明確檢測方法學(xué)，以便更換就診醫(yī)院時(shí)分析比對(duì)。最后周教授提出如果檢測項(xiàng)目有指南推薦的金標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，建議出現(xiàn)檢測結(jié)果按照金標(biāo)準(zhǔn)方法學(xué)出報(bào)告。比如雙鏈DNA的檢測，金標(biāo)準(zhǔn)就是使用綠蠅短膜蟲為基質(zhì)的間接免疫熒光法檢測。所以對(duì)于雙鏈DNA的檢測，如果出現(xiàn)不同檢測方法學(xué)不一致的情況，建議依據(jù)熒光結(jié)果來報(bào)告。

問題3：自身抗體檢測的室內(nèi)自制質(zhì)控品如何操作？又如何評(píng)價(jià)？

安成教授：自身抗體檢測的質(zhì)控品比較難以獲得，質(zhì)控品確實(shí)免不了要實(shí)驗(yàn)室自制。我們的自制質(zhì)控品就是從臨床上發(fā)現(xiàn)的一些樣本，然后進(jìn)行稀釋、評(píng)價(jià)、保存。自制質(zhì)控品的評(píng)價(jià)應(yīng)該包括重復(fù)性驗(yàn)證、均勻性驗(yàn)證、穩(wěn)定性驗(yàn)證等。以膜條印跡的ENA抗體質(zhì)控為例，會(huì)將收集到的不同陽性樣本混合在一起進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)一些難獲得、低濃度的抗體單獨(dú)加入反應(yīng)池中，防止樣本混合被稀釋而表現(xiàn)陰性。通常在2-8℃短可保存一周，但為了長期使用，需要放在-20℃條件下保存，為了避免反復(fù)凍融，可加入甘油，使其在-20℃條件下保持液體狀態(tài)，甘油的冰點(diǎn)和它的濃度相關(guān)，是一個(gè)U字形的關(guān)系，-25℃的冰點(diǎn)時(shí)，甘油的濃度在50%左右，-40℃的冰點(diǎn)時(shí)，甘油的濃度大約在60%左右，隨后隨著甘油濃度增加，冰點(diǎn)反而上升。穩(wěn)定性可通過破壞實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。

周海舟教授：我們的自制質(zhì)控品也是使用的臨床樣本來制作，選擇無溶血、黃疸、脂血、乳糜及渾濁等樣本，然后進(jìn)行離心、稀釋。用于間接免疫熒光的質(zhì)控品一般稀釋到濃度1:320后進(jìn)行保存。我們對(duì)自制質(zhì)控品的評(píng)價(jià)同樣包括重復(fù)性驗(yàn)證、均勻性驗(yàn)證、穩(wěn)定性驗(yàn)證這幾個(gè)方面。

       最后，李士軍教授感謝一味書院的大力支持，感謝講者和討論嘉賓的精彩分享，感謝線上聽眾的積極參與和關(guān)注，感謝一味書院、歐蒙亞太集團(tuán)及各位在線工作人員的辛勤付出，至此論壇圓滿結(jié)束。

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